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来自 246天天好彩特马资料 2019-09-06 11:31 的文章
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科学家设计出人工蛋白,中国科大在蛋白质设计

10月27日,中国科学技术大学生命科学学院刘海燕教授/陈泉副教授研究组在NatureCommunications上报道了蛋白质从头设计的最新成果,题为“Proteindesignwithacomprehensivestatisticalenergyfunctionandboostedbyexperimentalselectionforfoldability”。作者建立了一种新的统计能量函数,并将胞内进化方法应用于从头设计蛋白可折叠性的高效实验鉴定和改进,用其成功实现给定目标结构的蛋白全序列从头设计。

科学家设计出人工蛋白 或带来医学和材料学新革命

▎学术经纬/报道

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说到人工设计蛋白,华盛顿大学的大卫·贝克(David Baker)教授是业内当之无愧的“大神”。在计算模拟蛋白质功能,并进行人工设计上,这位50多岁的美国科学院院士率领的团队代表了领域的前沿。今年早些时候,他的团队就曾首次从头设计一款抗癌蛋白,其结果也登上了《自然》杂志。

David Baker正在展示他所在团队设计制作的人工蛋白模型。图片来源:Rich Frishman

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David Baker非常欣赏大自然的杰作。“这是我最喜欢的地方。”这位出生在美国西雅图市的科学家站在华盛顿大学的一个台阶上,欣赏着远处海拔4400米的雷尼尔雪山说。

大卫·贝克教授是人工设计蛋白领域的领军人物之一(图片来源:HHMI)

但如果跟着他走进实验室,你很快就会发现这位计算生化学家明显不只满足于自然界的馈赠,至少在分子领域是这样的。

日前,在顶尖学术期刊《科学》上,贝克教授团队再次带来了新的突破。这一次,他们设计的蛋白质会变形!

在其办公室里一张低矮的咖啡桌上,放着8个玩具大小的3D打印蛋白质复制品。一些呈环状和球状,一些则呈管状和笼状,在Baker及同事设计制作出它们之前,这些蛋白质模型均不存在。

蛋白为啥要“变形”?

过去几年,得益于基因组学和计算机学的革命性成果,Baker的团队已经解决了现代科学领域一个最大的挑战:解释氨基酸长链如何折叠为让“生命机器”运转的三维蛋白质。现在,他和同事已经通过这种方法设计并合成了非天然的蛋白质,这些蛋白质可以在医药到材料等不同领域发挥作用。

这项研究为啥能发表在《科学》上呢?这就要从它的意义说起。在计算机的辅助下,我们已经得到了一系列蛋白设计的原则,并能从头设计出具有最低自由能的氨基酸序列,让其形成的三维蛋白质结构具有超高的稳定性。

目前,这位蛋白质设计大师已经开发了一种实验性艾滋病病毒疫苗、旨在同时抵抗所有流感病毒毒株的新蛋白、将重组后的DNA运入细胞内的载体分子以及帮助微生物吸收大气二氧化碳并将其转化为有用化学物质的新酶。Baker团队及其合作者还报告称,他们正在用多达120种设计蛋白质制作进行可自我聚合的“笼子”,这将会打开通往新一代分子机器的大门。

这固然是人工设计蛋白的一大突破,但在实用性上却有着明显受限。这些人造蛋白太稳定了,就像是“岩石”一样硬邦邦。它们可以成为很好的结构框架,或是能与其他蛋白进行紧密结合,但在自然界中,许多天然蛋白更为灵活,能够在不同的环境下展现出不同的构象。这些蛋白也往往具有“开关”的功能,利用不同构象,来做不同的事。

如果说读写DNA引发了分子生物学的一场革命,那么设计新蛋白的本领将会在几乎所有事物身上带来革命。“没有人知道它意味着什么”,因为它有着影响数十个不同学科的潜力,马里兰大学帕克分校蛋白折叠专家John Moult说,“它完全是革命性的。”

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构建蛋白质的机制对地球上的所有生命来说都是最根本的。解决这一问题的一个方法是在实验上确定蛋白质的结构,比如通过诸如X光结晶法以及核磁共振检测等。然而,这些方法不仅缓慢,而且昂贵。即便在今天,国际蛋白质数据库仅储存着大约11万种蛋白质的结构,而科学家认为蛋白质的种类却有亿万种,乃至更多。

流感病毒血凝素蛋白的“变形”,对于释放流感病毒遗传物质至关重要

了解其他蛋白质的三维结构有助于生化学家洞察每个分子的功能。为此,Baker等计算机建模专家尝试利用计算机模型解决蛋白折叠的问题。

举个例子,流感病毒被内吞进细胞后,表面的血凝素蛋白会在酸性环境下“变形”,促使胞内体的细胞膜与流感病毒的脂质膜进行融合,从而让流感病毒的遗传物质顺利进入细胞质,开始复制。

研究人员想到了两种主要的折叠模型。其中,同源建模是将一个目标蛋白的氨基酸序列与一个模板(拥有类似序列且已知其三维模型的蛋白质)进行对比。但这种方法却存在一个主要问题:尽管研究人员已经进行了大量昂贵的X光结晶法以及核磁共振检测,但依然没有足够的已知其结构的蛋白质可以用作模板。

可以看到,“变形”能给蛋白质附加上许多额外的功能,也是科学家们想要理解和驾驭的蛋白质特性之一。但说起来容易,做起来难。自然界经过数十亿年演化而来的蛋白分子,其氨基酸序列不但能够形成理想的结构,还会根据周围环境做出改变。想要破解自然的密码,谈何容易?

而在20多年前,当Baker开始在华盛顿大学任教时,当时的模板数量就更少。这促使他跟踪第二种方式,即从头建模,该方法是通过计算相邻氨基酸之间的拉力和推力,以此预测蛋白质的结构。Baker还成立了一个生化实验室研究氨基酸之间的互动,从而帮助他建模。

尽显人类智慧

通过这种更加强大的计算能力,他们创建了一个众包性的外延项目(名字是Rosetta@home),该项目可以让人们将闲置的计算机用于需要进行的计算,从而研究所有潜在的蛋白折叠。随后,他们还添加了一个叫作Foldit的视频游戏外延,可以让偏远用户的独特蛋白折叠观点指导Rosetta的计算。该方法吸引了来自国际科学界的100多万名用户,此外还收到了包括从设计新蛋白到预测蛋白与DNA互动方式等在内的20多个软件包。

但贝克教授的团队做到了!

“David做的最聪明的一件事是成立了一个社群。”Baker此前的博士后、华盛顿大学蛋白设计研究所研究员Neil King说。现在约有400名活跃的科学家持续更新及改进Rosetta软件。该项目可供科研人员和非营利用户免费使用,但是会向企业收取3.5万美元的费用。

长年以来,这支团队积累的大量经验让他们把注意力集中到了一种叫做组氨酸的氨基酸上。在中性条件下,这种氨基酸不带有电荷。但当环境变为微酸性时,它就会带上正电荷,从而影响其形成氢键的能力。研究人员们推断,这个性质能帮助蛋白质“变形”。

尽管Rosetta非常成功,但其仍有局限性。该软件在预测氨基酸长度小于100的小蛋白质结构方面非常精确,但是和其他从头建模的软件一样,它在构建大蛋白质分子时却存在困难。几年前,Baker开始设想能解构大多数蛋白质结构的方法。

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上世纪90年代计算生物学家Chris Sander提出的一项技术给他打开了一扇窗户。Sanders等人很好奇基因序列是否有助于分辨那些展开时距离遥远、折叠成三维结构后彼此临近的氨基酸对。他推理认为,那些比邻的氨基酸对对蛋白质的功能非常关键,并提出那些对蛋白质结构非常必要的特定氨基酸对可能会共同演化。

组氨酸是蛋白“变形”的关键(图片来源:参考资料1])

Baker和同事意识到扫描基因组能够给Rosetta的从头建模提供新的约束条件,他们抓住了这个机会写了一个叫作Gremlin的新软件,可以同时对比基因序列,并呈现所有可能同时进化的氨基酸对。“我们很自然地将它运用到Rosetta中。”Baker说。

后续的研究也证实了这一设想的可靠。研究人员们利用计算机模拟,设计了一种合成蛋白。经过优化和纯化后,它能在中性条件下进行自我组装,成为多聚体。

其产生的结果非常有力,它让Rosetta成为普遍认为的最好的从头建模方式,而且它背后还有着更加深远的含义。5年前,从头建模仅仅确定了约8000个没有模板的蛋白质家族的56个蛋白。而从那以后,仅是Baker的团队就补充了900个蛋白质结构。哈佛医学院的Debora Marks认为,这种方式已经适用于4700个蛋白质家族。随着基因组数据大规模涌入科学库,Baker和Sander预测,让蛋白折叠模型拥有足够共同演化的氨基酸对数据以解开几乎任何蛋白质结构,可能只需要两三年时间。

接下来,便是见证神奇的时刻了。在酸性条件下,这些蛋白质的组氨酸快速带上了正电荷,从而破坏其蛋白内部的氢键网络,让组装好的多聚体开始解体。这种操作会让蛋白露出疏水残基,使其成为一个两性分子。这不但能促进蛋白单体与脂质膜结合,还能借此影响和破坏膜的结构,让膜出现融合。

对于Baker来说,这只是开始。随着Rosetta运算能力的稳步提升以及计算能力的日益强大,Baker的团队已经掌握了蛋白折叠的规律,他们已开始利用这些知识尝试“超越大自然的创作物”。“生物医学界几乎所有的东西都会因为能够制作出更好的蛋白质而受到影响。”哈佛大学合成生物学家George Church说。

使用冷冻电镜技术,研究人员们确认,在酸性条件下,这些蛋白果然可以与脂质体相结合。而在碱性环境里,这种结合能力就消失了。此外,研究人员们还确认,这种结合必须依赖组氨酸的存在。如果将组氨酸替换成其他氨基酸,即便在酸性条件下,这些蛋白也无法结合脂质体。

Baker注意到,数十年来科学家一直在追求一种他称之为“尼安德特人蛋白质设计”的策略,它意味着可以扭曲现有的蛋白基因,使其做一些新事情。“我们过去一直受限于自然界存在的物质……现在我们能够让生物进化走捷径,设计出解决现代问题的蛋白质。”

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而且,非天然蛋白质的潜在应用不只局限于医药领域。Baker及其同事还将一种叫作绿色荧光蛋白分子的120个副本聚合到一个笼子上,创建了当它们在组织内移动时能够通过光亮辅助研究的“纳米灯笼”。

酸性条件下,人工设计的蛋白可以结合并破坏脂质体的膜结构(图片来源:参考资料1])

预测氨基酸序列如何折叠的能力有助于了解蛋白质如何发挥作用,由此打开了设计出能够催化特定化学反应或是可用作医药、材料的新蛋白通道。这些蛋白基因能够在合成之后植入自然界生成蛋白质的微生物体内。去年,Baker的团队和合作者报告称他们在细菌体内设计了一种全新的新陈代谢通道,它是用一个人工设计的能让微生物将大气二氧化碳转化为燃料和化学物质的蛋白质实现的。

这些结果表明,通过人类的设计,蛋白的确在酸性条件下发生了“变形”,并且展露出理想的特质,使膜出现融合。

在一项或许可以称为迄今为止最发人深省的研究中,Baker团队设计了能够携带信息的蛋白,模仿DNA的4个核酸信使在DNA分子有名的双螺旋结构中结合、缠绕。现在,这些蛋白质螺旋结构尚不能传递细胞能读取的遗传信息。但它们具有深远的象征意义:蛋白设计者已经超越了自然的限制,现在限制他们的只有自己的想象力。“我们可以利用功能性蛋白建立一个全新的世界。”Baker说。

变革药物递送?

《中国科学报》 (2016-08-02 第3版 国际)

在哺乳动物细胞实验中,这种人造蛋白的“变形”能力再次得到了验证。首先,研究人员们在这种可变形蛋白上做了改造,让它们可以发出绿色荧光。然后,他们在细胞培养液中加入这些蛋白。

后续研究发现,细胞会把它们“一口吞下”。就像人依赖酸性的胃液消化食物,细胞也会把内吞物送到“溶酶体”里进行消化。有趣的是,这些蛋白与溶酶体的位置有着高度重合,说明它们已经进入到了溶酶体内部。但这些蛋白却依旧可以发出荧光,说明它们又没有被消化掉。

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进入溶酶体但不被降解,彰显了这些蛋白“变形”带来的效果(图片来源:参考资料1])

这些结果清楚地说明了蛋白的成功“变形”。研究人员解读说,在被细胞吞进去后,这些蛋白在酸性的溶酶体中开始变形,并借此破坏了溶酶体的膜结构。这就好像胃破了一个洞,让胃酸都流了出去一样,自然就削弱了溶酶体的消化能力。

同样,如果把这些可变形蛋白里的组氨酸变成其他氨基酸,这些蛋白也就失去了变形能力。在溶酶体中,它们被消化得干干净净。

在论文的最后,研究人员们指出,目前如果想要将生物制剂递送到细胞质中,需要使用许多比较“粗暴”的方法,因此可能带来毒副作用。病毒载体虽然显得不那么“粗暴”,却也会引起免疫上的风险。本研究中随pH值发生变形的蛋白,具有将胞内体中的分子释放到细胞质内的潜力,因此有望带来一种新颖的药物递送方法。

“设计能够以可预测的方式进行变化的蛋白质,有望带来分子药物的新浪潮,”贝克教授说道:“这些分子能够穿透胞内体,因此有潜力带来药物递送的新工具。”

参考资料:

1] Scott E. Boyken et al., , De novo design of tunable, pH-driven conformational changes, Science, DOI: 10.1126/science.aav7897

2] Designing biological movement on the nanometer scale, Retrieved May 16, 2019, from

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